荧光微球（时间分辨荧光微球、量子点荧光微球等）是侧向层析定量检测中常用的标记物。与胶体金的物理吸附不同，荧光微球通常通过共价偶联将抗体连接到微球表面，工艺更复杂，参数更敏感。

荧光微球标记抗体通常包含清洗—活化—清洗—偶联—封闭—清洗—复溶保存七个步骤。活化、偶联和封闭是三个最关键的环节。下面逐一拆解每个步骤的操作和注意事项。

一、微球清洗

商品化荧光微球的原液中含有微量表面活性剂、防腐剂等成分，这些成分可能会干扰后续的活化反应，须在标记前去除。

操作：

• 取固定量的微球
• 加入适量的缓冲液（50mM MES，pH 5.0-6.0）
• 13000-15000rpm离心20分钟，弃上清
• 用适量的缓冲液重悬微球
• 重复离心洗涤2-3次
• 然后用活化缓冲液（50mM MES,PH5.0-5.5)重悬微球

注意事项：

• 清洗后的上清液应澄清。如果上清仍然浑浊，说明可能洗涤不充分，需要增加洗涤次数或增加离心转速
• 离心后微球重悬可使用水浴超声清洗仪辅助分散，建议短时间超声，避免超声产热

二、微球活化

活化步骤的目的是将微球表面的羧基（-COOH）转化为可以与抗体氨基反应的活性酯。

操作：

• 称取NHS和EDC，用活化缓冲液（50mM MES，pH 5.0-5.5）溶解，现用现配
• 分别取NHS、EDC溶液加入到清洗后的微球中，快速混匀
• 室温孵育20-30分钟

注意事项：

• EDC对湿度非常敏感，受潮或结块后不建议使用。须-20℃保存，取出后迅速称量
• EDC和NHS溶液必须现用现配，不能提前配好放着
• 活化时间不宜过长，长时间可能增加微球聚集风险

三、活化后洗涤

活化完成后，体系中残留的EDC和NHS如果不去除，会干扰后续偶联反应。游离的EDC可能交联抗体，导致抗体聚集。

操作：

• 13000-15000rpm离心20分钟，弃上清
• 用适量的缓冲液重悬微球
• 重复离心洗涤2-3次
• 然后用标记缓冲液（PH7.0-8.0)重悬微球

注意：这一步不能省略。残留EDC会继续在溶液中“干活”，加入抗体后可能会交联抗体本身，而不是让抗体连接到微球上

四、抗体偶联

将抗体加入到活化好的微球中，抗体的氨基与微球表面的活性酯反应，形成稳定的酰胺键。

操作：

• 取不同的抗体量（选取5-8个用量浓度点）
• 加在活化后的微球里，快速混匀
• 室温偶联2小时左右

注意事项：

• 不同项目都需进行抗体使用量摸索优化
• 标记缓冲液的pH对抗体连接效率有影响
• 不同荧光微球使用的抗体量可能也不一样，需要进行摸索验证来达到最佳标记效果

五、封闭

封闭的目的是占据微球表面未反应的活性位点和疏水区域，减少后续使用中的非特异性吸附。

操作：

• 可使用BSA、乙醇胺来配置封闭液
• 微球标记抗体后，加入封闭液
• 室温孵育1小时

注意事项：

• BSA是最常用的封闭剂，酪蛋白也可作为备选
• 封闭时间不宜小于1小时
• 乙醇胺的作用是淬灭未反应的活性酯，与BSA协同封闭

六、去除未结合抗体

通过高速离心去除游离的未结合微球的抗体。

操作：

• 13000-15000rpm离心20分钟，弃上清
• 用标记缓冲液或封闭液重悬微球
• 重复离心洗涤2-3次

七、复溶保存

保存条件：

• 2-8℃避光保存
• 切勿冷冻
• 使用前确认微球处于均匀的悬浮状态

建议保存液：PH7.5-8.0的缓冲体系和2% BSA和5%-10%蔗糖和0.02% Proclin 300

常见问题与排查

1. 偶联后微球聚集

可能原因：

• EDC用量过高
• 离心过大
• 抗体用量过高
• 偶联pH不适当

排查方法：逐段拆开排查——洗涤、离心、活化、偶联、封闭和保存各环节逐一检查。离心后微球重悬可使用水浴超声清洗仪辅助分散。

2. 标记后背景偏高

可能原因：

• 封闭不充分
• 游离抗体未完全去除
• 微球自身非特异性吸附较强

3. 储存后信号衰减

可能原因：

• 保存液配方不合适
• 封闭不彻底导致微球缓慢聚集
• 保存温度不当或光照

4. 一步法与两步法的区别

一步法：活化剂和抗体同时加入。优点是步骤少、时间短，缺点是可能不是蛋白质的最佳偶联条件，偶联效率较低；由于多余EDC的存在，有些蛋白对此敏感，容易引起失活或标记失败。建议优先采用两步法（先活化洗涤，再加抗体）。